“如果我在大自然，我会这样做……”阿列克谢·奥洛夫尼科夫的生平和假说

　　

　　

　　在本文中，我们纪念杰出的老年学家、理论家阿列克谢·奥洛夫尼科夫(Alexey Olovnikov, 1936-2022)的一生和科学之旅。1971年，他发表了著名的“边缘切开术”假说，在该假说中，他预测了端粒的复制缩短及其作为细胞分裂和生物体生物年龄计数器的作用。这项工作提出了几个重要的假设，包括端粒酶的存在，这些假设在20年后得到了证实。尽管如此，阿列克谢·奥洛夫尼科夫(Alexey Olovnikov)在他对衰老的理论研究中取得了进一步的进展，并提出了一系列新的假设，这些假设看起来并不比曾经出现的边缘切开术假设更新奇。阿列克谢·奥洛夫尼科夫(Alexey Olovnikov)看待生物学问题的方式非常独特，除了衰老之外，他还提出了关于发育、生物节律和进化的惊人概念。

　　在国际科学界，阿列克谢·马特维耶维奇·奥洛夫尼科夫(Alexey Matveyevich Olovnikov, 1936-2022)最著名的是他在端粒缩短及其在衰老中的作用方面的富有远见的工作(1971-1973)(图1)。同事们都知道他是一个有趣的健谈者，总是关注未解决的生物学问题。阿列克谢的尖锐问题能把最沉闷的研讨会搞得热闹起来。对他的家人和所爱的人来说，他是一个开朗、温和、不苛求的人，对一切都充满好奇。但对每个人来说，他的主要特点是显而易见的——独创性，这体现在每件事上，从日常生活(比如把文件铺在地板上，因为桌子上的空间永远不够)到他一生的理论生物学工作，他的文章可以被称为任何东西，而不是普通的。Alexey也非常喜欢术语和缩写，为了表彰这一点，我们将给他自己的缩写，并进一步称他为AMO。在这篇文章中，我们将简要介绍他的科学道路、边缘切开术理论的历史和演变，以及最近解释发育、进化和衰老的假说。

　　图1所示。

　　

　　阿列克谢·马特维耶维奇·奥洛夫尼科夫(1936-2022)。

　　AMO的科学之旅始于1953年他在莫斯科国立罗蒙诺索夫大学生物学院生物化学系学习。在大学期间，AMO对免疫学产生了兴趣，并在列夫·齐伯(Lev Zilber)的指导下，进入了免疫学和肿瘤系Gamaleya流行病学和微生物研究所的研究生课程，列夫·齐伯是一位有着非凡成就和艰辛的人。Zilber是鼠疫和其他疾病疫苗的发明者，是发现癌症抗原的先驱，也是癌症病毒理论的创始人之一[1]。在Gamaleya研究所，AMO研究了应用免疫学的各种主题(图2)。他的实验工作和博士论文主要关注免疫吸附剂作为诊断和免疫工具的发展。他与导师Aron Gurvich在《自然》杂志上共同发表的一篇文章装饰了他的论文发表清单[2]。在这篇文章中，他们描述了在兔子免疫过程中通过抗原与不溶性载体的共价交联来增强免疫原性。从1966年到1969年，一种新的免疫化学方法被称为聚集血凝，它允许高度敏感的检测可溶性抗原。除其他用途外，该方法已用于检测微生物毒素和肿瘤标志物甲胎蛋白[3-7]。AMO翻译了几本书籍，包括F. Burnet的《The Integrity of The Body》(1964)和E. Cooper的《Comparative Immunology》(1980)[8,9]。1977年，AMO成为化学物理研究所的组长，在那里他开发了免疫化学方法并指导研究生。AMO的晚年是在n.m.伊曼纽尔生物化学物理研究所度过的。

　　AMO对免疫学的兴趣持续了很长时间。1972年，他提出了“转基因的等位”机制来解释抗体多样性。这一机制暗示了所谓的“转基因”的组合，即许多序列不同的DNA片段并置在特定位点上[10]。根据DNA中编码的转基因的数量，从这些序列中形成的抗体可变区域可能导致大量的变异。根据他的假设，单个转基因的重组预计会通过一个被称为“外拷贝”的过程发生，这涉及到单个转基因的染色体外拷贝的产生，这些拷贝将结合成一个编码基因。我们现在知道这是一个染色体内重组过程。

　　AMO的理论发现超前于他们的时代，但在很大程度上没有引起人们的注意，因为它们没有发表在可访问的期刊上。AMO的免疫学假说于1972年10月在亚美尼亚Tsaghkadzor举行的“抗体生物合成的分子遗传学基础”研讨会上提出，并于1974年由Gamaleya研究所发表在《免疫学问题》上[10]。大约5年后，Tonegawa Susumu发现在B淋巴细胞分化过程中，免疫球蛋白重链和轻链的可变区是由多个片段组合而成的，每个片段在多个不同变体的免疫球蛋白基因位点中都有代表。这种重组产生了抗体多样性。由于这一发现，利根川获1987年诺贝尔生理学或医学奖。

　　图2所示。

　　

　　Alexey Olovnikov在Gamaleya研究所(1960年)。

　　AMO的假设有时非常复杂，包含了许多额外的结构，这些结构可能会掩盖主要观点。尽管他文章中的陈述得到了已发表的结果的支持，但逻辑结论往往是如此不同寻常、出乎意料和新颖，以至于被认为是幻想，甚至引发了拒绝和抗议。终末复制不足或染色体边缘切开术(染色体末端缩短)理论就是这种情况，该理论于1971年首次发表在《苏联科学院院刊》上[11,12]。这是AMO最著名的理论著作。令人惊讶的是，不仅对这种现象本身的存在，而且对由此产生的生物学后果的准确预测，后来引起了人们真正的兴趣，因为这些预测是在端粒缩短及其分子机制被发现和研究之前很久做出的。

　　这一发现的故事始于1966年组织学家Alexander Friedenstein的一次演讲，AMO在演讲中听说了Leonard Hayflick最近发表的数据，即正常体细胞(成纤维细胞)不能在体外无限分裂，在大约50倍后它们就停止了[13]。此外，这些细胞有一个计数加倍的程序:经过20次分裂后，海弗利克将细胞冷冻在液氮中;解冻后，细胞分裂30次。换句话说，细胞“记住”它们已经经历了20次分裂，只剩下30次了。

　　AMO说，这个事实让他非常震惊，以至于他想不起其他事情[14]。如何安排细胞分裂计数程序?像往常一样，一个重要的解释出现了。在描绘复制复合体如何工作的过程中，AMO得出结论:DNA不能在末端复制，如果可以的话，每加倍一次，它的末端就会变短。DNA缩短到一定的临界极限会导致端粒附近基因功能障碍和细胞死亡。当时诞生的端粒衰老理论将计算细胞分裂次数的计时器的作用归因于端粒缩短，从而解释了海弗利克极限。

　　许多基于AMO当时完全推测性的切缘假说的预测得到了证实。例如，端粒末端由重复的缓冲DNA序列组成，作为消耗品，这一事实已被实验证实[15,16]。关于存在一种特殊的DNA聚合酶的假设，在生殖细胞和干细胞分裂期间补偿端粒的缩短，也得到了出色的证实[17,18]。由于这种酶，种系不会衰老，并确保遗传信息在无限代中充分传递。这种特殊的逆转录酶被称为端粒酶，最初是在纤毛虫四膜虫中发现的，并由Elizabeth Blackburn和Carol Greider描述[19]。

　　在描述端粒酶发现历史的文章中，Blackburn和Greider写道，直到1988年，当Calvin Harley提请他们注意这项工作时，他们才知道这位苏联科学家的假设[20,21]。受到这一假说的启发，Greider和Harley决定测试人类细胞中的染色体是否会缩短，以及在Tetrahymena中观察到的这一过程是否如AMO所预测的那样是一种普遍的生物现象[22]。从那时起，对终端复制问题的研究开始呈指数级增长。

　　除了端粒酶，AMO预测了自然界为种系不朽而设计的机制也为一种病理开辟了可能性:体细胞可以劫持端粒酶，走上无限增殖的道路[12]。事实上，端粒酶在约85%的癌症中被激活[23]。在边缘切开术理论中，细菌进行无限复制的能力和它们的“不朽”可以用它们的染色体的圆形形式来解释:因为一个圆圈没有尽头，细菌不需要补偿性的DNA聚合酶。我们现在知道了另一种保护端粒的方法。果蝇缺乏端粒酶，但染色体末端的延伸是通过使用专门的可移动元件进行的:能够通过逆转录复制自身的反转录转座子附着在染色体末端[24]。在AMO的假说中还提出了其他几个假设，包括“抗边缘切开术”(即端粒延长)可能具有治疗应用。最后，但并非最不重要的是，AMO假设端粒缩短和“参与调节下丘脑和其他体内平衡中心活动的细胞死亡”是衰老的主要原因。

　　最重要的是，AMO对发育和衰老的机制，以及引导生物体从出生到死亡的整个个体发育过程的遗传结构感兴趣。最初，端粒理论理想地描述了衰老过程。然而，随着时间的推移，越来越多的数据表明，端粒理论适用于培养的细胞，但无法解释整个生物体的衰老。例如，在比较野生小鼠和实验室小鼠时，发现它们的端粒长度存在显著差异，实验室小鼠的端粒最长可达10倍[25]。人们可能会认为它们应该比野外的同类活得更长，但它们的寿命是一样的。端粒酶缺失小鼠也被培育出来，它们完全存活，尽管端粒酶缺失，但繁殖良好，衰老速度与其他小鼠相似[26]。只有在第4代或第5代才开始出现问题，而第6代结果是不育。同样，在同一生物体内，不同组织中的有丝分裂计数器是不同步的，允许不同数量的复制。没有发现亚端粒“衰老信号”，甚至在衰老细胞中，即细胞已经耗尽了它们的分裂潜力，染色体的末端始终充满端粒结合蛋白，并保护它们不受外切酶的影响。尽管端粒理论的预测得到了全面证实，但AMO希望它能成为解释生物体衰老原因的普遍原理，但这一希望并没有实现。他认为，端粒缩短只是衰老的一个见证，而不是衰老的原因[27]。

　　因此，这个故事又回到了原点:对边缘切开术作为衰老的解释感到失望，AMO将其应用限制在解释细胞培养的“寿命”上，这是该假设的最初目的。有必要找到一个新的解决办法。

　　应该指出的是，端粒在衰老中的作用仍在积极研究中。例如，根据最近的研究发现，无论端粒长度如何，衰老细胞都会出现端粒功能障碍，一些研究者认为端粒损伤是触发细胞死亡的重要检查点[28,29]。此外，还有一种端粒中心理论，根据该理论，许多衰老迹象，包括线粒体功能障碍、炎症激活、染色质结构破坏和蛋白质稳态变化，都是通过端粒功能障碍激活的[30,31]。端粒在衰老中的作用是本期几篇文章的主题，也是《生物老年学》特别纪念刊的主题，题为“端粒与健康和长寿”。

　　AMO是程序性衰老的支持者，并且确信这个程序有一个特定的遗传机制，涉及一组有限的因素，自然很容易根据进化和人口需求来调节。AMO在之前的假设中发现了一些不一致之处，他进一步发展了这一假设，使其更加普遍[27,32 -34](图3)。新衰老理论的主要内容可以概括如下:(i)边缘切断术是一种可靠的细胞复制计数方法;(ii)然而，染色体末端的缩短并不在生物体衰老中起根本作用;(iii)必须考虑到Vladimir Dilman的神经内分泌衰老理论[35]，AMO认为这是解释动物衰老的核心。(iv)衰老是个体发生的一个完整阶段，因此必须存在一个统一的发育调控机制——从出生到死亡。

　　图3所示。

　　

　　阿列克谢·奥洛夫尼科夫在老年学会议上发表讲话(2000年)。

　　AMO提出，细胞在活跃分化状态下的维持及其老化是基于特殊的(仍然是假设的)染色体外线性DNA分子的缩短，这些分子携带调控基因，并受到端粒重复序列的保护，类似于线性染色体。他把这些分子称为“打印粒”——特定染色体区域的“打印体”[32-34]。一旦从其染色体起源复制，组织特异性打印粒在分裂细胞中起作用，以确定和维持细胞特化状态。AMO认为，在胚胎发生的早期阶段，当短暂的形态素暴露决定了特定细胞群的命运时，印刷粒的产生是实现位置信息的一种手段。根据该假说，打印粒通过分解某些染色质区域来编码负责表达特定基因的小rna[32,36]。该假说假定染色质相对于核膜有严格的定位。小RNA通过结合到靠近核膜的染色体上的互补位点上，可以短暂地打开核孔(因此这种类型的RNA被称为fRNA -喷泉RNA)。由于离子从核周空间在一个严格限定的位置迅速流入细胞核，染色质发生分解，从而激活一组控制给定细胞分化途径的基因。染色质的rna依赖离子调控也可能参与x染色体失活、基因位置效应和遗传显性现象。AMO假设，“真核生物”发明了“包围核质和染色体的核周池，只是为了能够严格地局部、有针对性地、依赖离子地操纵它们的染色质数据库”。随着时间的推移，打印粒的缩短可导致维持染色体结构基因必要活性的调控rna的剂量减少。然而，AMO并不认为这一假设是详尽的，因为它解释了个体分化细胞和组织的活性和衰老，而不是整个生物体的协调功能。

　　根据迪尔曼的神经内分泌理论，中央管理机构(“生理最高管理者”)，在高等动物中是中枢神经系统(CNS)，负责指导发育、组织和维持整个生物体的平衡功能，并决定其衰老。考虑到这项工作，AMO认为大脑的神经元有自己的打印端，他称之为“chronomeres”，并根据生物年龄控制生物体的成熟和衰老[27,33,37,38]。在这个修正后的理论中，衰老现在不是通过端粒本身的缩短来解释的，而是通过染色体外DNA末端的缩短来解释的，从而减少了维持特定类型细胞中基因活性所需的调节RNA的剂量。更具体地说，生物钟控制着中枢神经系统神经内分泌和神经营养中心的激素及其受体的表达。因此，它们调节着生物体中发生的各种各样的过程。AMO将衰老称为“数量性状疾病”，是由这些染色体外计数器的临界缩短后基因活性下降引起的。

　　新假说的另一个重要观点是，有丝分裂后神经元的时轴缩短应该以与红外线节律同步的波发生。AMO的这一结论是基于Walter Pierpaoli的工作，他通过实验研究了神经内分泌器官，特别是松果体在动物发育和衰老中的作用[39,40]。在他的论文[37]中，AMO详细描述了他对这一过程的设想。最重要的是，他得出了节律不可能是内源性的结论。地球上的所有生物都受到地球物理自然的外部循环影响，这不可避免地影响了它们的生命过程。分别于2005年和2022年发表的两个假设，探讨了地球上最可靠、最永恒的节奏驱动因素——引力对发育和衰老的影响[37,41](图4)。这些引人注目的衰老概念将我们的目光从显微镜上转移开，提醒我们生活在地球这个宇宙环境中。例如，2005年发表的一项假说假设，松果体细胞(松果体细胞)中存在一种生理“月球传感器”，在月球周期变化和月球引力影响下，松果体细胞对钙化(长期描述的“脑砂”)的机械作用做出反应[37]。这一机制解释了激素释放的突然激增、发育周期的变化和其他现象。

　　图4所示。

　　

　　Vladimir Skulachev, Alexey Olovnikov和Vladimir Anisimov在斯特龙博利岛(意大利)的老年学会议上，由Walter Pierpaoli(2005)组织。

　　在他最新的“节拍器”假说中，AMO提出了一种关于衰老原因的新观点，拒绝了他在整个职业生涯中一直支持的特殊程序的存在[41]。然而，他不能否认存在一种非常特殊的生理机制来测量生物时间。与月球传感器假说类似，这里认为生活在地球上的生物是强大的外部地球物理力持续影响的目标。这种力是地轴的周期性移动，导致脑脊液流动方向的变化，由脑室的纤毛神经元(也是一种众所周知的细胞类型)感知。这反过来又被提出触发由影响发育的“时间DNA”介导的表观遗传机制。在这一假说中，衰老被视为发育的后生殖阶段，当主要目标——生命的繁殖——实现时，暂时的DNA被耗尽。月球传感器和节拍器之间的关系仍未得到解释。然而，考虑到AMO的科学远见，他的所有假设都值得研究。

　　AMO的观点在他的职业生涯中不断演变。AMO经过多年的发展，形成了由一系列概念组成的新的一般假设，其复杂性越来越大，纳入了各种假设机制和新术语，理解难度也越来越大[42]。然而，值得再次注意的是，其基本原理是:(i)“副基因组”的存在，即暂时性的染色体外功能DNA分子，(ii)中枢神经系统对发育过程的集中调控，以及(iii)内部分子(切缘)和外部地球物理两个计时器的无情影响。每一种现象都有大量的实验证据。

　　介绍

　　科学之路的开端。免疫学研究

　　衰老的端粒理论

　　发展和老龄化的一般理论

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　　连理论

　　阿列克谢·奥洛夫尼科夫解决科学问题的方法

　　结论

　　参考文献。

　　致谢。

　　作者信息

　　道德声明

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　　AMO的研究兴趣并不局限于衰老、生物节律和个体发生。像许多生物学家一样，他被自然选择的有限选择问题所困扰，因为随机发生的有利突变的百分比很低。达尔文自己也注意到了随机误差的不足，而且“从那时起——AMO写道——这个老刺仍然留在进化论的身体里”[43]。在发现自己处于不寻常栖息地的生物体中，适应性进化只有在及时和足够的基因组变异性的情况下才能成功。如果突变是选择的燃料，那么及时提供这种燃料的机制对进化和自然选择一样重要。杂交在这里没有帮助:盲目的基因洗牌不会产生根本的新特征。AMO提出了一种专门的“进化机器”(“creatron”)模型[43,44]。根据这一假说，为了有针对性地修改生殖细胞基因组，即产生非随机突变，必须将分子信号从“运动器官”(根据Lamarck的说法)传递到生殖细胞的基因组。在文章[45]中，AMO为胚胎学家所熟知的神秘事实提供了一个解释:原代生殖细胞在进入性腺之前通过发育中的胚胎迁移。他认为这恰好是由原代生殖细胞获得的组织特异性标记，使成年生殖细胞能够接受这些器官的分子信号，这些信号是它们的前代(原代生殖细胞)在早期器官发生时接触到的。根据该假说，接收来自器官的信号并经过处理后将其重定向到性腺的中继接口是身体部位在大脑中的神经元投影，类似于“Penfield’s homunculus”[43-45]。来自特定器官的跨神经元信号传递是有针对性的，这意味着它被定向到非随机的生殖细胞群。因此，进化机器应该表现为信号的传输，从一个因环境变化而功能异常的器官，到大脑中的神经元投影，再从那里到性腺，在那里“组织特异性”生殖细胞将接收信号。该方案的最终结果是生殖细胞基因组中严格定义的位点的表观遗传修饰，这些位点对应于“运动”(应激)器官。地形上的非随机表观遗传变化发生在种群中，并传递给后代，导致后代有益变化的频率急剧增加。经过几代人的进化，表观遗传变化成为基因固定的可能性增加了。进化理论的进一步发展致力于解决哪个分子可以作为非随机遗传变化的信号的问题。2022年，一个扩展的进化假说被发表，讨论了稳定的环状rna作为体细胞到性腺的信使的可能作用[43]。值得注意的是，已经出现了环境应激影响下动物生殖细胞小rna水平变化的文献[46]。这些变化被认为是适应变化的生活条件的开始。

　　在此，我们对AMO的工作做一个简单而肤浅的概述。并不是他所有的想法都发表了，尽管他仔细地研究了每一个假设。通常，当面对一个未解决的问题时，他会收集有关该主题和看似无关的主题的大量文献，与专家进行讨论，在某种程度上，所有这些都有助于他从更广阔的角度考虑问题，并在已知的生物过程的结构和功能组织背景下确定缺失的环节。AMO在一篇关于形态发生的文章中描述了他的方法:“只有通过卫星才能看到整个海洋，从卫星上看不到海浪，但可以清楚地分辨水下洋流和其他海洋奥秘。在这项工作中，我试图像在卫星上一样上升，意识到根本不可能回顾所有关于形态发生的文献，但尝试以新的视角看待这个迷人过程中一些尚未解决的谜团并给出我自己的解释是很有趣的”[47]。

　　AMO有一种罕见的能力，能看到不明显的事情，而且不害怕谈论它。当然，并不是他所有的结论和想法都能被证实，但是当他发表的时候，他总是很自信，甚至说如果他在大自然的位置，他会完全按照他的建议去做。同时，他认为批评和破坏性的问题很容易扼杀一个新生的脆弱的假设，所以他在一段时间内小心翼翼地保护新的想法，不与任何人分享。AMO的文章充满了信息，因为除了假设之外，那里还放置了许多带有详细解释的推论。不可否认的是，AMO的文章很难阅读，它们经常用建立在假设之上的详细假设让读者感到厌倦甚至恼火[42]。很难预测他的文章中哪些内容将被证明是有远见的，或者他的哪些观点将被激励研究人员去检验。但是，我们要再次强调，也应该从更高的角度来考虑这些假设，提取关键因素- -思想和原则。

　　必须承认，AMO是非常幸运的，在缺乏积极推广的情况下，他的一个预测不仅得到了实验的证实，而且开创了一个新的科学领域，使他得到了全世界的认可。几十年来，端粒生物学一直处于科学的前沿，在端粒调控方面的发现似乎是无穷无尽的(端粒重复序列的转录、端粒信号传导、端粒重组延伸等)。2009年，当一组发现并研究端粒酶的科学家获得诺贝尔奖时，AMO的知名度达到了顶峰。AMO本人也被提名为该奖的科学家之一，但没有获奖。许多人想知道他是如何处理这样的失望。然而，对于任何熟悉AMO的人来说，很明显他的世界观并不包含怨恨或失望。AMO写道，他很高兴自己的假设得到了证实，并按时发表了[21]。他在1966年写了这篇文章，直到1971年才在一家俄罗斯杂志上发表，1973年才在一家国际杂志上发表。2010年冬天，AMO获得了德米多夫奖(Demidov Prize)，这是一个1831年设立的荣誉科学奖(图5)。在他的就职演讲中，AMO当然谈到了他的主要工作，端粒缩短，引用了亚历山大·普希金(Alexander Pushkin)的诗句作为引文:“……日子过去了，每一个小时都从我们身上带走了一点东西”。

　　图5所示。

　　

　　阿列克谢·奥洛夫尼科夫和他的妻子娜塔莉亚·奥洛夫尼科夫在德米多夫奖颁奖典礼上(2010年2月)。

　　也许对某些人来说，AMO可能看起来很奇怪，不寻常，甚至是奢侈的人。然而，当涉及到科学时，他总是非常积极地响应和参与。他非常重视自由——不受教条、时间表和手续的束缚。我们有时用“正直的人”这个词，而AMO就是它的缩影。他绝不是一个世故的人，他爱他的家庭，对一切都感兴趣——从政治到学术八卦——同时，他的生活中总是有一种快乐而清晰的光芒:他对科学的热情。

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